文献类型：专利

专利类型：发明专利

是否失效：否

是否授权：否

申 请 号：CN202310177680.3

申 请 日：20230228

发 明 人：赵礼军 李阳 熊建民 李静静

申 请 人：河南省华隆生物技术有限公司

申请人地址：453000 河南省新乡市新飞大道1789号高新区火炬园

公 开 日：20230714

公 开 号：CN116426473A

代 理 人：李真真

代理机构：洛阳公信联创知识产权代理有限公司

语　　种：中文

摘　　要：本发明涉及一种NKG2D阳性的外泌体、制备方法及应用，属于外泌体领域，本发明采取肝癌细胞系源的外泌体对脐带血NK细胞/成人NK细胞进行培养期的特异性处理，以收集含有特异性的NKG2G标记的外泌体，来抑制肝癌细胞的增殖。本发明利用创新性的肿瘤源的外泌体对NK细胞培养特点，规模化提取活化后的NK细胞NKG2GD阳性的外泌体，以达到治疗肝癌的目的。

主 权 项：1.一种NKG2D阳性的外泌体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、胎牛血清外泌体的去除：采用超速离心结合免疫吸附柱的方法，去除胎牛血清中的外泌体；步骤二、HepG2细胞的培养：包括细胞复苏和细胞传代，采用完全培养基复苏冻存的细胞，然后进行传代培养；所述完全培养基为α-MEM+10%未去除外泌体的FBS；步骤三、HepG2细胞外泌体的收集：取细胞上清，采用超离心分离外泌体，弃上清，用PBS重悬沉淀，则外泌体存在于重悬液中；步骤四、NK细胞的分离与培养：（1）将新鲜血液于2900r/min离心10min，吸取上层淡黄色血浆与50ml离心管，40℃水浴30min，然后1500r/min离心10min中去除沉淀，将上层血浆转移至新的50ml离心管置于4℃冰箱保存备用；（2）第0天，起始培养：起始培养体积为20ml，细胞接种密度1×10⁶/ml，培养液为：GT-561；（3）补液：第1天细胞数增多，培养液有发黄，加液10ml GT-561；若细胞密度增加不明显，则推迟到第2天补液；（4）第3天，将步骤（3）得到的培养液按300×g离心8min，弃去上清，用新鲜的GT-561悬浮沉淀，并调细胞密度为1×10⁶/ml，置于培养箱中培养；（5）第4天观察细胞，若细胞状态良好，培养液无明显发黄，则不做处理；如果细胞密度明显增大，加GT-561使细胞密度为1×10⁶/ml；（6）第5天，若第4天未处理，且细胞状态良好，密度大，培养液发黄，加GT-561使细胞密度为1×10⁶/ml；（7）转移培养袋：第6-7天计数，细胞数量大于100M，则加入5支1ml滋养细胞，如细胞数量在30-60百万，则长至第8天再添加滋养细胞；补加GT-561，使总细胞浓度在1.0×10⁶ /ml；培养液体积大于100ml或细胞数量大于100M，则转移至T175培养，随培养体积加大，再逐步转移到细胞培养袋培养；（8）第8-11天每天观

关 键 词：肝癌细胞系 肝癌细胞 创新性  规模化 培养期  脐带血 活化  制备  肝癌 增殖  肿瘤  治疗  应用  

IPC专利分类号：C12N5/0783;A61K35/17;A61P35/00;A61P3/10;A61P19/02;A61P9/12