文献类型：专利

专利类型：发明专利

是否失效：否

是否授权：否

申 请 号：CN202010360644.7

申 请 日：20200430

发 明 人：刘文 张庆林 冯俊寅 潘佳明 陈单丹 王杰

申 请 人：中国科学院上海有机化学研究所 中国科学院上海有机化学研究所湖州生物制造创新中心

申请人地址：200032 上海市徐汇区零陵路345号

公 开 日：20250829

公 开 号：CN113584068B

代 理 人：肖艳;徐迅

代理机构：上海一平知识产权代理有限公司 31266

语　　种：中文

摘　　要：本发明提供了一种VWB‑attP和φC31‑attP整合酶介导的基因重组方法及在链霉菌中应用。具体地，本发明利用VWB‑attP整合酶和φC31‑attP整合酶系统介导的位点特异性整合机制将这两种整合酶模块构建在同一个含有目的基因的质粒中，通过属间接合转移可快速将需要表达的目的基因以多拷贝的数量重组至链霉菌染色体的相应attB位点上。本发明的方法在阿维菌素，红霉素和林可霉素产生菌中进行了应用。

主 权 项：1.一种利用VWB-attP整合酶介导的林可链霉菌基因重组方法，其特征在于，包括步骤：(1)在林可链霉菌出发菌株Streptomyces lincolnensis NRRL2936的基因组CysteateNRPS基因簇中引入外源的VWB整合酶所识别的attB位点，取代该基因簇的原SLINC0744基因，所述外源的VWB整合酶所识别的attB位点序列如SEQ ID NO:5所示；其中所述林可链霉菌的基因组中包含选自下组的内源的attB位点：(a)位于林可链霉菌SLINC_t29的VWB整合酶所识别的attB位点1’，其序列如SEQ IDNO:5所示；(b)位于林可链霉菌SLINC_3666与SLINC_3667间隔区的VWB整合酶所识别的attB位点2’，其序列如SEQ ID NO:6所示；和(c)位于林可链霉菌SLINC_3671与SLINC_3672间隔区的VWB整合酶所识别的attB位点3’，其序列如SEQ ID NO:7所示；(2)将包含(i)VWB整合酶模块、和(ii)目的基因或目的基因簇的载体引入到步骤(1)的林可链霉菌中，选择目标基因或目标基因簇整合到链霉菌基因组内源attB位点以及外源attB位点的链霉菌，从而获得整合入多拷贝基因或基因簇的链霉菌，其中，所述的内源attB位点为位于林可链霉菌的VWB整合酶所识别的内源的attB位点1’；并且所述的目的基因簇为林可霉素生物合成基因簇。

关 键 词：VWB-attP  整合酶 介导 基因重组  链霉菌 林可  出发菌株  STREPTOMYCES lincolnensis  NRRL  基因组  CysteateNRPS  基因簇 引入  外源  识别  attB  位点 取代  SLINC  位点序列  SEQ  ID  NO  选自  内源  SLINC_t  IDNO  间隔区  模块  

IPC专利分类号：C12N 15/76;C12N 15/74;C12N 1/21;C12N 15/52;C12R 1/565;C12R 1/465;C12R 1/01