文献类型：专利

专利类型：发明专利

是否失效：否

是否授权：否

申 请 号：CN201310611552.1

申 请 日：20131125

发 明 人：曹毓琳 左百乐 栗炳南 连杰 林俊堂 丰慧根

申 请 人：河南省华隆生物技术有限公司

申请人地址：453003 河南省新乡市金穗大道688号商会大厦B座22楼

公 开 日：20150715

公 开 号：CN103602706B

代 理 人：潘雯瑛;秦雪梅

代理机构：44224 广州华进联合专利商标代理有限公司

语　　种：中文

摘　　要：本发明公开了一种MUC1和GM-CSF双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有MUC1基因、IRES序列和GM-CSF基因，或者沿载体转录方向依次连接有GM-CSF基因、IRES序列和MUC1基因；所述MUC1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。本发明所述的双基因共表达重组载体，采用IRES序列来连接MUC1基因和GM-CSF基因，能够在同一载体中同时表达人上皮粘蛋白以及粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子，该重组载体可用于肿瘤的基因免疫治疗，既能发挥细胞因子的免疫调节作用，又能靶向性地产生特异性抗肿瘤效应。

主 权 项：1.MUC1和GM-CSF双基因共表达重组载体pIRES2-MUC1-GM-CSF的制备方法，包括以下步骤：a)获得含有特异性酶切位点的MUC1基因片段：从乳腺癌细胞MCF-7获取cDNA作为模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位点序列的MUC1特异性引物进行PCR扩增，得到含有Bgl II和EcoR I酶切位点的MUC1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；b)构建pIRES2-MUC1-EGFP重组载体：用限制性内切酶Bgl II、EcoR I分别酶切pIRES2-EGFP质粒以及步骤a)得到的MUC1基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2-MUC1-EGFP重组载体；c)获得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段：从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的GM-CSF特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到GM-CSF基因片段混合物，其中的一种GM-CSF基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端；d)构建pIRES2-MUC1-GM-CSF重组载体：用限制性内切酶BstX I、Not I酶切步骤b)得到的pIRES2-MUC1-EGFP重组载体，将步骤c)得到的GM-CSF基因片段混合物与酶切后线性化的pIRES2-MUC1-EGFP重组载体混合，采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2-MUC1-GM-CSF重组载体；其中，步骤a)所述的MUC1特异性引物为：MUC1上游引物：5’-GAAGATCTATGACACCGGGCACCC-3’，MUC1下游引物：5’-TTGAATTCCTACAAGTTGGCAGAAGTGG-3’；步骤a)所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环，72℃最终延伸5min；步骤c)所述的GM-CSF特异性引物包括GM-CSF第一引物对和GM-CSF第二引物对，所述的GM-CSF第一引物对由GM-CSF上游长引物和GM-CSF下游长引物组成，所述的GM-CSF第二引物对由GM-CSF上游短引物和GM-CSF下游短引物组成：GM-CSF第一引物对为：GM-CSF上游长引物：5'-AACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3'，GM-CSF下游长引物：5'-GGCCGCTCACTCCTGGACTGGCTC-3'；GM-CSF第二引物�

关 键 词：基因 核苷酸序列  重组载体  序列表  双基因共表达 转录  连接  基因免疫治疗 集落刺激因子 免疫调节作用  特异性抗肿瘤  巨噬细胞  细胞因子  粒细胞 靶向  蛋白  肿瘤  

IPC专利分类号：C12N15/85(20060101);C12N15/66(20060101);A61K48/00(20060101);A61P35/00(20060101)