文献类型：专利

专利类型：发明专利

是否失效：否

是否授权：否

申 请 号：CN201310474494.2

申 请 日：20120210

发 明 人：马飞 王宇环 罗晓玲

申 请 人：深圳市合一康生物科技有限公司

申请人地址：518052 广东省深圳市高新技术产业园紫光信息港大厦B栋404-406室

公 开 日：20150211

公 开 号：CN103571913B

代 理 人：魏亮

代理机构：33217 杭州华鼎知识产权代理事务所(普通合伙)

语　　种：中文

摘　　要：本发明属于细胞免疫学技术领域，具体地说是一种人γδT细胞对K562细胞株的杀伤活性检测方法。用于检测制成的人γδT细胞。本发明包括以下步骤：制备人γδT细胞后取对数生长期的K562细胞株作为靶细胞，并调整细胞密度为1×105/ml、5×104/ml、2.5×104/ml，每孔取100μl铺于96孔培养板中，培养24小时，取制备的人γδT细胞调密度为1×106/ml，加入96孔培养板中，使效靶比分别为10∶1、20∶1和40∶1，各密度设3个复孔并分别设置空白对照计算杀伤活性。通过这样的方法确保人γδT细胞的毒性。

主 权 项：1.一种人γδT细胞对K562细胞株的杀伤活性检测方法，其特征在于：首先制备一种人γδT细胞，包括：（1）用培养的结核杆菌制备结核杆菌耐热性抗原，其具体步骤为：步骤1：将结核杆菌菌体种子湿重50～100克接种于200ml的苏通式液体培养基内，于37℃培养箱内静止培养2周，然后将其分装到含有10%～30%新生牛血清的250ml的苏通式液体培养基内，每瓶50ml，分装成4瓶，再继续于37℃培养箱内静止培养4周，收集培养的细菌悬液，经4000转/分，离心30分钟以收获结核杆菌菌体；步骤2：将收集的菌体经生理盐水洗涤2次，再用2倍体积的蒸馏水重悬浮菌体，115℃高压蒸汽处理20分钟，4000转/分，离心30分钟收集上清液，即为Mtb-Hag；（2）用制备的Mtb-HAg刺激PBMCs，同时加入细胞因子rhIL-2和rhIL-21，其具体步骤为：无菌条件下用血细胞分离机或50ml注射器采集患者外周静脉血，经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞，具体步骤为：1500转/分，离心10分钟，吸取上层血浆层，56℃灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按1:2的比例加入离心管中，2000转/分，离心20分钟，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速分别为1600转/分，1300转/分，均离心7分钟，即得到外周血单个核细胞；将上述分离的PBMCs置于含有刺激剂和细胞因子为1～10μg/ml的Mtb-HAg、50～500IU/ml rhIL-2、5～20ng/ml rhIL-21和1%～10%自体血浆的RPMI1640、AIM-V或GT-T551培养基内，调细胞密度为（1～2）×10⁶/ml，转入细胞培养板、培养瓶或培养袋内，于37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱内培养；（3）细胞培养72小时后进行半量更换培养液并补加等量的rhIL-2，以后根据细胞生长状态每2～3天进行补加含有等量rhIL-2的培养液，以维持细胞密度为（0.5～2.0

关 键 词：细胞 培养板  细胞株 活性检测方法  对数生长期  细胞免疫学 空白对照  细胞密度 靶细胞 复孔  检测  培养  

IPC专利分类号：C12Q1/20(20060101);C12R1/32(20060101)