文献类型：专利

专利类型：发明专利

是否失效：否

是否授权：否

申 请 号：CN200810059816.6

申 请 日：20080204

发 明 人：周正兵 俞保彬 高留根

申 请 人：杭州华锦药业有限公司

申请人地址：310013 浙江省杭州市西湖区塘苗路18号

公 开 日：20100609

公 开 号：CN101226138B

代 理 人：余木兰

代理机构：33209 杭州天欣专利事务所

语　　种：中文

摘　　要：本发明公开了一种促肝细胞生长素活性检测方法。该检测方法，采用RPMI-1640培养液，检测包括准备试剂步骤、供试品溶液制备步骤、测定供试品组3孔吸收度平均值、对照组3孔吸收度平均值和空白对照组3孔吸收度平均值步骤、计算刺激指数步骤，其特点是：所述的RPMI-1640培养液采用不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养液。本发明克服了现有技术存在的测试不稳定，重复测定一致性差等缺陷，具有测定方法稳定，测定结果可靠，检测数据重复率较高、一致性较好等优点，测定结果能正确反映供试品的活性。

主 权 项：1.一种促肝细胞生长素活性检测方法，使用RPMI-1640培养液，检测包括准备试剂步骤、供试品溶液制备步骤、测定供试品组3孔吸收度平均值、对照组3孔吸收度平均值和空白对照组3孔吸收度平均值步骤、计算刺激指数步骤，其特征在于：所述的RPMI-1640培养液采用不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养液，所述的促肝细胞生长素活性检测方法分以下步骤：A、试剂配制：a、配制pH7.3的0.01mol/L磷酸盐缓冲液，取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠Na₂HPO₄ 1.15g及磷酸二氢钾0.2g，加超纯水1000ml溶解后，高压灭菌备用；b、配制10％小牛血清培养液，取不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养液900ml，加已灭活的新生小牛血清100ml；c、配制0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液，取0.25g胰蛋白酶及0.02g乙二胺四醋酸二钠，加0.01mol/L磷酸盐缓冲液100ml溶解后，用5.6％碳酸氢钠调节pH值至7.2，过滤除菌，-20℃保存备用；d、配制MTT噻唑蓝溶液，取MTT50mg，加0.01mol/L磷酸盐缓冲液10ml溶解后，过滤除菌，保存于冷处，使用不超过两周；B、供试品溶液制备：用不含谷胺酰胺的RPMI-1640培养液将供试品制成每1ml中含多肽100μg的溶液；C、测定供试品组3孔吸收度平均值、对照组3孔吸收度平均值和空白对照组3孔吸收度平均值：a、用10％小牛血清培养液培养SMMC-7721细胞至对数增长期，用0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液消化，加10％小牛血清培养液稀释至每1ml中含2.5×10⁴～5×10⁴个细胞，将上述细胞悬液在96孔细胞培养板上铺板，每孔100μl，其中留3孔加10％小牛血清培养液100μl作为空白对照，置37℃、5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养3～4小时使铺在细胞培养板孔上的对照品和空白对照品贴壁；b、在细胞培养板每孔上加供试品溶液100μl，每批供试品均做3孔�

关 键 词：培养液 促肝细胞生长素 活性检测方法  计算刺激指数  溶液制备步骤  空白对照组  平均值步骤  检测数据 试剂步骤  谷氨酰  检测  

IPC专利分类号：G01N21/00(20060101);C12Q1/02(20060101)